摘要: 从已公布的红鳍东方鲀的BAC测序数据库和ESTs数据库中搜索微卫星序列，设计并合成PCR引物。用传统的形态学性状选择方法，从收集到的三个红鳍东方鲀养殖群体中筛选出体型完好的各30-50个个体组成三个品系，作为进一步进行品系间杂交和家系选择的基础群体，并用上述微卫星标记对这三个品系进行基因型分析，以鉴定品系内的基因多样性水平和品系间的遗传距离，为设计最佳的育种技术路线提供基础数据。

1．引言

红鳍东方鲀（Fugu rubripes）是日本人喜好的名优水产品，在我国民间也有冒死吃河鲀之谚语，这都说明河鲀确实是一种美味。目前河鲀鱼的出口量很大，2004年产量3500吨，产值3亿多人民币，养殖业者较为青睐。可惜的是河鱼鲀的选育种研究一直开展的较少，基本上还处于天然状态。目前养殖者多从国外进口鱼卵和进口鱼养殖的第二或三代亲鱼繁殖的鱼苗，就是在日本也没有建成品种。但随着养殖密度的增加、随着从人工养殖群体中获取鱼苗使病害增加，致使养殖群体的遗传衰退现象也显现出来并影响到产品的质量，最终降低养殖业户的经济效益。病害和种质衰退警示我们红

鳍东方鲀已到了必须培育优良品种的阶段了。水产养殖动物的育种目前已到了分子育种阶段，分子育种所依据的是与家系相关的分子标记和与性状相关的分子标记或功能基因。与性状相关的标记多是通过数量性状的连锁定位而获得，这需要有一个目标生物的密度适度的遗传连锁图谱作为工具。由于红鳍东方鲀作为养殖生物其遗传基础研究还很少，目前相关的研究报道还比较少。

红鳍东方鲀由于其基因组只有人基因组的1/7左右，且具有脊椎动物所必须的一切功能基因。由此使其成为人基因组全基因测序与功能基因鉴定的模式生物。红鳍东方鲀的基因组信息目前是鱼类中最多的，有大量的基因组DNA序列和EST序列的信息。这些为开展标记辅助的育种研究提供了有价值的工具。只是由于没有遗传连锁图谱这一遗传研究的更有力的工具，使标记辅助育种所需的与经济性状相关的标记难于获得。

本文鉴定出的微卫星标记不仅为目前正在进行的品种选育提供了工具，也为建立遗传连锁图谱准备了一些标记；另外本研究家系选育所用的实验材料也为建立遗传连锁图谱提供了做图样本库。

2．材料和方法

2．1红鳍东方鲀实验群体的采集：

分别从庄河养殖场、河北省采集了三个群体，共70个个体，平均体重在1.8公斤。

2．2群体间1对1繁殖：按计划做7组1对1繁殖，获得子代分池饲养以检测最佳育种组合。

2．3模板DNA的提取：常规方法处理，酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）抽提，乙醇沉淀，TE溶解，4℃保存备用。

2．4微卫星引物设计：从红鳍东方鲀的BAC序列数据库和EST序列数据库中筛选到微卫星序列，并设计、合成PCR引物，其方法同另一研究论文“红鳍东方鲀BAC数据库和ESTs数据库中微卫星的筛选与应用”。

（好图片：0108，0122-4，0130-3，0181-1，0183-2，0191-3，0204-1，0226-2，0233-2a,0240-1）

2．5 群体与亲本的基因型分析：以庄河、河北一号和河北二号的群体中每个个体的基因组DNA为模板，用设计出的对微卫星引物进行PCR扩增。反应条件为94℃ 5min变性；然后40个循环，每个循环包括94℃ 30s，退火30s，72℃ 30s；最后72℃ 7min。扩增产物用1.4%琼脂糖凝胶电泳分离。用GDS8000型凝胶成像系统（UVP公司）观察拍照、记录分析。

3．研究进展

3．1基础群体的建立：通过型态测定，从庄河、河北1号、河北2号群体中去除体型不好，个体极度小和有病的个体，建立三个品系，作为进一步品系筛选的基础群体，暂定名为“庄河”、“河北1号”、“河北2号”。

3．2 筛选到的BAC-SSRs与EST-SSRs序列：从BAC库中检测获得11个微卫星序列，双碱基重复序列有11个（见表1）；ESTs中检测得11个微卫星序列（EST-SSRs），双碱基重复序列有6个，三碱基重复序列有4个，四碱基重复序列有1个（见表2）。

3．3 BAC-SSRs与EST-SSRs序列：从BAC库中检测获得110个微卫星序列，双碱基重复序列有个，三碱基重复序列；从ESTs序列中检测得到11个微卫星序列（EST-SSRs），双碱基重复序列有6个，三碱基重复序列有4个，四碱基重复序列有1个。

3．4 标记的鉴定结果

经优化PCR反应条件筛选每对引物的最佳退火温度，然后分别对每对引物进行PCR扩增。所得产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。22对引物均扩增出产物，但产物大小及分布情况不尽相同。除了F0185、F0191、F0225产物无多态性外，其余引物都具有多态性。图1.图2分别为F0191和F0130的部分扩增结果。

表1 红鳍东方鲀BAC库中筛选的微卫星序列

表2 红鳍东方鲀ESTs数据库中筛选的微卫星序列

图1引物F0191部分扩增结果

图2引物F0130部分扩增结果

3．5 EST-SSRs的位置分析：在UK MRC HGMP-RC The Fugu Genomics Project的网页上查找的11个EST-SSRs来源及标记的基因所在BAC库上的位点被列在表3。（http://fugu.hgmp.mrc.ac.uk/）

表3红鳍东方鲀 EST-SSRs在EST的位置及标记基因

3．6 基础群体遗传多样性：用14个微卫星标记对庄河群体的34个样品，河北1号的18个样品，河北2号的19个样品进行了基因型分析，对数据的初步统计分析是河北2号的平均杂合度最高为0.669, 河北1号为0.647，庄河群体为0.637。结果表明这三个群体的遗传多样性比较丰富，仍有很大的育种潜力。所检测的14个基因位点，全部纯合的和全部杂合的仅各一个位点，其它12个位点属多样性位点，即纯合与杂合各有部分个体，有趣的是在纯合基因型个体中，以短基因位点纯合占绝大多数，占95%，并不符合长基因座位与短基因座位纯合各占50%的理论推论，原因有待进一步研究。

3．7 家系的建立：取上述测定的庄河群体中，取个体间基因位点差异较大的雌雄各一尾进行1对1 交配，繁殖了子代，仔鱼单独养殖，生产性能和基因型待测定。取上述测定的不同群体（庄河♀对河北1号♂，庄河♀对河北2号♂）进行交配，已产出几万尾鱼苗，已开始养殖。这些子代的生产性能与基因型的关系将在进一步的研究加以测定。

4．讨论

4．1随着ESTs数据库不断地增长，已有很多物种成功的开发了EST-SSRs标记。基因组EST 是反映转录加工后的mRNA的信息，而不能反映基因组DNA的真实信息，所以在一些物种中的有些微卫星引物不能扩增出目的片段或者扩增出的目的片段与预期的不符。出现这种情况出现的原因可能是选取的微卫星引物序列在EST中存在而在基因组中却没有相应的序列,比如处于跨越内含子的两个外显子的拼接交界处,或者在转录的修饰区中,这样都可能引起一端或两端的引物无法和基因组DNA模板结合而使扩增失败。或者由于在基因组中两个引物序列之间出现了大片段的内含子,大片段的内含子使扩增产物太大,在普通PCR反应中无法扩增片段过大的产物，使扩增反应失败。另外，基因组DNA含有一些非转录区，这些区域导致从基因组中扩增的片段长度大于ESTs中的片段长度。在红鳍东方鲀ESTs数据库中随机选择的11对微卫星引物均扩增出产物，其中9对引物所得产物含有预期片段长度，只有F0225和F0233的产物长度比预期片段长度大。这可能与河豚的基因组中内含子较小，结构比较紧凑有关[]，这一结果也表明从河豚ESTs数据库筛选微卫星引物作为遗传与育种研究的标记是一个有效途径。

4．2SSR 的片段长度和其稳定性在不同物种间和同一物种内部的位点间是有变化的,许多数据表明EST-SSRs标记要比传统SSR标记的多态性低[]。本次试验数据也体现出BAC-SSRs比EST-SSRs的多态性高。但有些EST-SSRs引物扩增的产物多态性比较高，如F0240等位基因数高达12。有趣的是来源于EST不同位置的SSR揭示的多态性也不同，红鳍东方鲀的5´ –ESTs要比3´ -ESTs含有较多的多态性SSRs。这些多态性较高的EST-SSRs引物可应用于红鳍东方鲀的遗传多样性分析。遗传多样性是指生物种内不同群体之间或群体内不同个体间遗传变异的总和,它是生物多样性的基础和重要组成部分。对红鳍东方鲀遗传多样性的研究,有助于其亲本选配。遗传多样性的核心是基因多样性,而EST-SSRs 正好反映了生物基因表达转录部分，由于与基因相关联，EST-SSRs属于Ⅰ型标记，是分子标记中最有价值的标记。因此,将EST-SSRs 应用于红鳍东方鲀遗传多样性研究,可揭示与红鳍东方鲀适应性变异相关基因功能的多样性。此外，EST-SSRs的开发可以使无功能的分子标记向可揭示基因转入功能的分子标记转化，用于已知功能基因的定位。又由于EST-SSRs 是基因的一部分,在长期的进化与选择过程中必然有一些基因得到选择,而使群体的遗传多样性丧失。据此可选用一些在野生红鳍东方鲀中表现多态而在养殖红鳍东方鲀中无多态性的EST-SSRs 用于筛选重要经济性状的基因。本研究结果初步证实了使用存在于红鳍东方鲀EST数据库中的SSRs进行遗传学分析是可行的，并且这些EST-SSRs也可用于其它方面的研究。

4．3纯合个体中的短等位基因纯合型比例过高是不符合遗传学理论的。如果一个基因座位的一对等位基因经杂交分离再重组，最终两种基因型纯合的个体的比例应该相等或相近，在本研究的三个群体中的12个基因座位，短等位基因型纯合个体占绝对多数，原因是不清楚的。可能的原因是长基因型纯合位点与控制低抗病力或低生存能力基因相关，使长基因型纯个体多数死亡，使现有群体中的短基因型个体成为优势个体，短基因型与杂合型个体成为优势个体。

4．4 下一步的研究工作。红鳍东方鲀虽然有比较丰富的基因组资源，通过这些资源我们可以方便的获得共显性标记和Ⅰ型标记这些在选育种中极度为有用的工具。但是红鳍东方鲀还没有遗传连锁图谱，没有这个图谱对鉴定我们在育种中最为需要的经济性状相关标记的研究是不利的。本课题组的下一个目标之一就是建立红鳍东方鲀的遗传连锁图谱，这需要准备一个质量高的做图样本库，我们正在建立一个适合做图的家系；还需要大量的共显性分子标记，主要还是如本文中所叙述的技术路线继续筛选家系多态性的微卫星分子标记。建立一个适于经济性状定位分析（QTL）的样本库并进而鉴定出红鳍东方鲀主要经济性状如生长、抗病等的相关标记与相关基因也是本研究的主要方向之一。

5．致谢。本研究由大连天正有限公司资助。作者向参与本研究的和给予本研究帮助的其他同事梁利群研究员，闫学春副研究员，曹顶臣、耿波、常玉梅、鲁翠云助理研究员等致以谢意。